La PCR et le séquençage

Objectif

Comprendre comment on amplifie puis lit une séquence d'ADN, et à quoi servent ces techniques.

1. La PCR : principe

La Polymerase Chain Reaction, inventée par Kary Mullis (Nobel 1993), amplifie in vitro un fragment d'ADN choisi. Le mélange contient l'ADN matrice, deux amorces encadrant la région à copier, les quatre dNTP, une ADN polymérase thermostable (Taq polymérase, issue de Thermus aquaticus) et un tampon contenant du Mg²⁺.

Chaque cycle comporte trois étapes :

1. Dénaturation à 95 °C : séparation des deux brins.
2. Hybridation à 50–65 °C : fixation des amorces, à une température dépendant de leur composition en G-C.
3. Élongation à 72 °C : synthèse du brin complémentaire, environ 1 000 bases par minute.

L'amplification est exponentielle : N = N₀ × 2^n. Après 30 cycles, une seule molécule donne théoriquement 2³⁰ ≈ 1,1×10⁹ copies, en moins de deux heures.

2. PCR quantitative et RT-PCR

La qPCR suit l'amplification en temps réel grâce à un marqueur fluorescent. On mesure le Ct (cycle seuil) : plus la quantité initiale d'ADN est grande, plus le Ct est faible ; un écart d'un cycle correspond à un facteur 2 sur la quantité de départ.

La RT-PCR ajoute une étape préalable de transcription inverse (ARN → ADN complémentaire) : c'est le principe des tests de dépistage du SARS-CoV-2, où un Ct inférieur à 30 traduit une charge virale élevée.

3. Le séquençage

• Méthode Sanger (1977) : incorporation aléatoire de didésoxynucléotides marqués qui stoppent l'élongation ; les fragments de toutes les longueurs sont séparés par électrophorèse capillaire. Précision excellente, lecture de 600 à 1 000 bases. Reste la référence pour vérifier une construction ou une mutation ponctuelle.
• NGS (séquençage haut débit) : des millions de fragments sont séquencés en parallèle sur une puce. Le génome humain (3,2 milliards de paires de bases) est lu en un jour pour quelques centaines d'euros, contre 13 ans et près de 3 milliards de dollars pour le Projet Génome Humain achevé en 2003.
• Troisième génération (nanopores) : lectures très longues, appareils portables, utiles au séquençage de terrain lors d'épidémies.

4. Applications

Diagnostic d'infections, dépistage de mutations en oncologie (biopsies liquides), identification génétique en criminalistique et tests de filiation, contrôle des OGM en agroalimentaire, phylogénie et suivi des variants viraux.

5. Précautions

La sensibilité de la PCR expose au risque de contamination : locaux séparés pour la préparation et l'amplification, cônes à filtre, témoin négatif systématique. Un témoin positif valide le bon fonctionnement des réactifs.

À retenir

• Trois étapes par cycle : 95 °C, ~60 °C, 72 °C ; amplification en 2^n.
• qPCR : le Ct mesure la quantité initiale.
• Sanger = précision ; NGS = débit.